湖南农业大学研究生院 湖南农业大学研究生院宿舍
长沙臭豆腐“闻起来臭、吃起来香”，是南方半发酵型臭豆腐代表之一，主要工艺是将豆腐坯浸入发酵卤水一段时间，油炸后拌佐料供人们休闲食用，其加工和风味来源关键在于发酵卤水。卤水制作多沿用传统敞口式发酵，风味品质不稳定。目前关于卤水的研究主要集中在挥发性风味物质和微生物多样性等方面。
韶关学院英东食品学院唐 辉和湖南农业大学食品科学技术学院蒋立文*等以豆腐、冬笋、梅干菜、香菇等原料为基质发酵长沙臭豆腐卤水，利用hs-spme-gc-ms、内标定量法结合香气活性值（o**）跟踪卤水发酵过程中挥发性成分、特征风味物质及其动态变化情况，在此基础上，采用鸟枪法宏基因组学探究不同发酵时期卤水的优势菌群，通过pearson相关系数分析卤水中优势菌群与特征风味成分之间的相关性，寻找卤水中风味关联菌，以期为稳定长沙臭豆腐风味品质，促进其现代化生产提供理论和应用基础。
1、长沙臭豆腐卤水发酵过程中理化指标的变化情况
如图2所示，卤水ph值先降后升，在发酵第6天降到最低，发酵60 d左右趋于稳定。这主要是因为发酵前期，糖类、脂肪和蛋白质等物质在微生物的代谢下产酸，卤水的ph值急速下降，于发酵第6天降到最低。随着发酵时间的推移，微生物此消彼长，一些产碱微生物的复苏和繁殖，糖类、脂肪和蛋白质不断分解代谢出碱性物质，导致ph值升高，发酵60 d左右时，体系ph值趋于稳定。
2、长沙臭豆腐卤水发酵过程中挥发性风味物质和特征风味物质的变化情况
如图3所示，卤水发酵过程共鉴定到75种挥发性风味物质，其中，醇类22种、酸类8种、醛类2种、酮类9种、酯类18种、醚类3种、苯酚类4种、吲哚类2种和其他类7种。发酵0、6、15、30、45、60、90、120 d卤水中挥发性风味物质总种类分别为16、30、31、42、27、33、25、14种，在发酵第30天出现高峰；总质量浓度分别为3.01、305.42、562.05、365.8、629.56、120.62、21.87、2.49 μg/ml，在发酵第15、45天出现2个高峰（562.05 μg/ml和629.56 μg/ml）。
由图4a可知，苯酚和吲哚类物质种类较稳定（苯酚有3～4种，吲哚有2种），且含量很高，但含量在发酵过程中的变化较大，呈先升后降，再升再降的变化趋势，且两者都在发酵第15、45天出现峰值。其中，苯酚类物质在第45天，出现最高峰值（428.32 μg/ml），吲哚类物质在发酵第15天出现最高峰值（244.19 μg/ml）。由图4b可知，醇、酸、酯类物质种类和含量较高，变化较大，都呈先升后降的变化趋势，其中，醇类在发酵第30天达最高种类（15种），酯类的种类在发酵第6、30天（12种）达到2个高峰期，酸类在发酵第15天达到最高种类（6种），三者的含量均在发酵第6天，达到较高水平。由图4c可知，醛、酮和醚类物质种类较少，含量也较低，整个发酵过程较为稳定。
如表1所示（仅列出不同发酵阶段卤水中o**不小于1的19种特征风味物质，其余56种物质在各阶段卤水中o**均小于1，因此未列出），发酵0、6、15、30、45、60、90、120 d的卤水中挥发性风味物质o**不小于1的分别有3、9、13、11、9、10、3、3种，新鲜卤水原料中（发酵0 d）1-辛烯-3-醇的o**较高（220），是其主要的特征风味物质，呈蘑菇和蔬菜香；在卤水发酵过程中（发酵6～120 d）o**较高的特征风味物质主要有苯酚、对甲基苯酚、吲哚和3-甲基吲哚等。
综上所述，卤水在整个发酵过程中，特征风味物质的种类和含量不断变化，其中，苯酚、对甲基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚贯穿卤水整个发酵过程，是其中主要的特征风味物质，亦或是长沙臭豆腐“闻起来臭，吃起来香”的主要原因。丁酸、3-甲基丁酸、4-乙基苯酚、三甲胺是长沙臭豆腐“闻起来臭”的另一原因。异戊醇、2-庚醇、正己醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-十一醇、苯乙醇、合金欢醇、3-苯丙酸**、丙位十二内酯和壬醛等特征风味物质或是长沙臭豆腐“吃起来香”的另一原因。
3、长沙臭豆腐卤水发酵过程中菌群结构的变化
臭豆腐卤水微生物群落界水平的组成
通过注释得到不同发酵阶段卤水中微生物在界水平的丰度统计与差异比较，见表2。
基于种水平臭豆腐卤水微生物多样性结果
从图5可以看出，基于种水平，发酵卤水5个样本中微生物数目依次为stb45＞stb60＞stb15＞stb30＞stb0，共鉴定出8 483种微生物，其中，2 817种微生物在不同发酵阶段的卤水中被检测到，这些菌可能与卤水发酵过程**同检测到的风味物质形成相关。有42、234、10、32、87种微生物分别为stb0、stb15、stb30、stb45、stb60独有，这些微生物可能与卤水在不同发酵阶段的独特代谢产物的形成相关。
臭豆腐卤水发酵过程菌群结构变化情况
如图6所示，本实验仅将每个样品中相对丰度不小于1%的种单独呈现于柱形图中，小于1%的统一归属为其他（others）。5个样品中相对丰度不小于1%的菌种总丰度占微生物总丰度60%以上，即能表达样本总微生物的主要信息。虽然在不同发酵阶段卤水中鉴定到大量的共有物种（2 817种），但是相对丰度不小于1%的物种差异较大，发酵前（0 d）与发酵后（15、30、45、60 d）卤水样本中的主要物种种类差异明显，这是由于发酵前后卤水体系的ph值发生较大变化（见2.1节结果），一些非嗜酸菌如微小杆菌等逐渐被替代。发酵后卤水中的主要物种有一定演替变化，但总体上比较相近，推测发酵后卤水**有的主要物种是发酵阶段的主要特征风味形成的功能菌种。
菌群结构与特征风味成分之间的相关性分析
为了进一步探究优势菌群与特征风味之间的关系，以种水平下微生物相对丰度不小于4%的优势菌群与19种特征风味成分含量进行pearson相关性分析，见图7，图中越接近红色，正相关性越强，越接近蓝色，负相关性越强。从图7可以看出，与19种特征风味物质有相关性（p＜0.05）的优势菌群有11种，其中，与c. bacterium sysu ga17129有相关性的特征风味物质数目最多，有8种，包括苯酚、丁酸、丙位十二内酯、吲哚、对甲基苯酚、3-甲基丁酸、2-庚醇、正己醇。与a. ane**inilyticus有相关性的特征风味物质数目较多，有6种，包括3-甲基丁酸、苯酚、3-甲基吲哚、丁酸、丙位十二内酯、1-辛烯-3-醇。与s. acetigenes有相关性的特征风味物质数目也较多，有5种，包括2-庚醇、正己醇、3-苯丙酸**、丁酸、异戊醇。这3种优势菌与12种特征风味物质相关（p＜0.05），涵盖了大部分的特征风味物质，尤其是c. bacterium sysu ga17129、a. ane**inilyticus与主要特征风味物质苯酚、对甲基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚有显著相关性（p＜0.05）。
结论
本实验对长沙臭豆腐卤水发酵过程特征风味物质和优势菌群及其相关性进行研究，明确与卤水特征风味关系密切的主要风味关联优势菌，但这些优势菌群的功能基因、参与的代谢通路及对特征风味物质形成所起的作用、卤水发酵商业菌种的开发等还需进一步研究。
一
通信作者简介
蒋立文，1968.11出生，湖南安化人，教授，博士，湖南农业大学博士生导师，现为食品科学与生物技术湖南省重点实验室主任，兼任国家自然科学基金评审委员会专家，天津市、浙江省、北京市自然科学基金项目评审专家，中国微生物学会会员，中国豆制品产业（刊物）专家，中国酿造杂志社编委，湖南省食品科技学会理事，湖南省调味品协会理事，湖南省质量技术监督局食品安全专家，湖南省食品质量安全技术协会监事。围绕湖南特色的发酵豆制品、发酵蔬菜等领域存在发酵机理不明、微生物资源研究有限、生产条件粗放、产品质量不稳定、无法实现标准化规模化商品化生产等问题开展研究，在毛霉菌发酵豆豉品质形成机理、南方特色臭豆腐风味形成指纹图谱、发酵蔬菜品质控制、食品安全控制方面取得较好研究成果，主持国家自然科学基金面上项目支持2项，主要参与省部级项目3项，主持或参与项目发酵大豆制品、蔬菜发酵制品及技术分别获得湖南省科技进步奖三等奖1项（排名第一）、湖南省技术发明三等奖1项（排名第一），湖南省科技进步二等奖1项（排名第三）。主持制定或参与制定湖南省地方标准2项。获得授权的国家发明专利10项。公开发表科研**50余篇，主编/副主编参与教材编写4部。
二
第一作者简介
唐辉，女，1983年出生，湖南永州人，博士，韶关学院 讲师，韶关市科协智库专家。长期致力于传统发酵食品研究领域，专注于传统发酵食品酸笋、臭豆腐等食品风味及其形成机理方面的研究，对食品发酵过程中产生的苯酚类物质的代谢形成机理有较深入的研究，先后主持国家自然科学基金项目1项、广东省自然科学基金项目级1项、广东省教育厅科研项目1项、韶关市科技局项目3项，科研经费累计达70多万元；在food chemistry、《食品科学》等国内外优秀杂志上发表科研**20余篇，其中sci/ei收录10余篇。
本文《长沙臭豆腐卤水发酵过程特征风味物质及其关联菌群分析》来源于《食品科学》2023年43卷22期239-248页，作者：唐辉，陈霖，康林芝，李跑，钟瑞敏，刘国凌，蒋立文。doi:10.7506/spkx1002-联系本站老师。-019。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
food science of animal products（**sn: 2958-4124, e-**sn : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/jo**nal/2958-4124
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韶关学院英东食品学院唐 辉和湖南农业大学食品科学技术学院蒋立文*等以豆腐、冬笋、梅干菜、香菇等原料为基质发酵长沙臭豆腐卤水，利用hs-spme-gc-ms、内标定量法结合香气活性值（o**）跟踪卤水发酵过程中挥发性成分、特征风味物质及其动态变化情况，在此基础上，采用鸟枪法宏基因组学探究不同发酵时期卤水的优势菌群，通过pearson相关系数分析卤水中优势菌群与特征风味成分之间的相关性，寻找卤水中风味关联菌，以期为稳定长沙臭豆腐风味品质，促进其现代化生产提供理论和应用基础。
1、长沙臭豆腐卤水发酵过程中理化指标的变化情况
如图2所示，卤水ph值先降后升，在发酵第6天降到最低，发酵60 d左右趋于稳定。这主要是因为发酵前期，糖类、脂肪和蛋白质等物质在微生物的代谢下产酸，卤水的ph值急速下降，于发酵第6天降到最低。随着发酵时间的推移，微生物此消彼长，一些产碱微生物的复苏和繁殖，糖类、脂肪和蛋白质不断分解代谢出碱性物质，导致ph值升高，发酵60 d左右时，体系ph值趋于稳定。
2、长沙臭豆腐卤水发酵过程中挥发性风味物质和特征风味物质的变化情况
如图3所示，卤水发酵过程共鉴定到75种挥发性风味物质，其中，醇类22种、酸类8种、醛类2种、酮类9种、酯类18种、醚类3种、苯酚类4种、吲哚类2种和其他类7种。发酵0、6、15、30、45、60、90、120 d卤水中挥发性风味物质总种类分别为16、30、31、42、27、33、25、14种，在发酵第30天出现高峰；总质量浓度分别为3.01、305.42、562.05、365.8、629.56、120.62、21.87、2.49 μg/ml，在发酵第15、45天出现2个高峰（562.05 μg/ml和629.56 μg/ml）。
由图4a可知，苯酚和吲哚类物质种类较稳定（苯酚有3～4种，吲哚有2种），且含量很高，但含量在发酵过程中的变化较大，呈先升后降，再升再降的变化趋势，且两者都在发酵第15、45天出现峰值。其中，苯酚类物质在第45天，出现最高峰值（428.32 μg/ml），吲哚类物质在发酵第15天出现最高峰值（244.19 μg/ml）。由图4b可知，醇、酸、酯类物质种类和含量较高，变化较大，都呈先升后降的变化趋势，其中，醇类在发酵第30天达最高种类（15种），酯类的种类在发酵第6、30天（12种）达到2个高峰期，酸类在发酵第15天达到最高种类（6种），三者的含量均在发酵第6天，达到较高水平。由图4c可知，醛、酮和醚类物质种类较少，含量也较低，整个发酵过程较为稳定。
如表1所示（仅列出不同发酵阶段卤水中o**不小于1的19种特征风味物质，其余56种物质在各阶段卤水中o**均小于1，因此未列出），发酵0、6、15、30、45、60、90、120 d的卤水中挥发性风味物质o**不小于1的分别有3、9、13、11、9、10、3、3种，新鲜卤水原料中（发酵0 d）1-辛烯-3-醇的o**较高（220），是其主要的特征风味物质，呈蘑菇和蔬菜香；在卤水发酵过程中（发酵6～120 d）o**较高的特征风味物质主要有苯酚、对甲基苯酚、吲哚和3-甲基吲哚等。
综上所述，卤水在整个发酵过程中，特征风味物质的种类和含量不断变化，其中，苯酚、对甲基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚贯穿卤水整个发酵过程，是其中主要的特征风味物质，亦或是长沙臭豆腐“闻起来臭，吃起来香”的主要原因。丁酸、3-甲基丁酸、4-乙基苯酚、三甲胺是长沙臭豆腐“闻起来臭”的另一原因。异戊醇、2-庚醇、正己醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-十一醇、苯乙醇、合金欢醇、3-苯丙酸**、丙位十二内酯和壬醛等特征风味物质或是长沙臭豆腐“吃起来香”的另一原因。
3、长沙臭豆腐卤水发酵过程中菌群结构的变化
臭豆腐卤水微生物群落界水平的组成
通过注释得到不同发酵阶段卤水中微生物在界水平的丰度统计与差异比较，见表2。
基于种水平臭豆腐卤水微生物多样性结果
从图5可以看出，基于种水平，发酵卤水5个样本中微生物数目依次为stb45＞stb60＞stb15＞stb30＞stb0，共鉴定出8 483种微生物，其中，2 817种微生物在不同发酵阶段的卤水中被检测到，这些菌可能与卤水发酵过程**同检测到的风味物质形成相关。有42、234、10、32、87种微生物分别为stb0、stb15、stb30、stb45、stb60独有，这些微生物可能与卤水在不同发酵阶段的独特代谢产物的形成相关。
臭豆腐卤水发酵过程菌群结构变化情况
如图6所示，本实验仅将每个样品中相对丰度不小于1%的种单独呈现于柱形图中，小于1%的统一归属为其他（others）。5个样品中相对丰度不小于1%的菌种总丰度占微生物总丰度60%以上，即能表达样本总微生物的主要信息。虽然在不同发酵阶段卤水中鉴定到大量的共有物种（2 817种），但是相对丰度不小于1%的物种差异较大，发酵前（0 d）与发酵后（15、30、45、60 d）卤水样本中的主要物种种类差异明显，这是由于发酵前后卤水体系的ph值发生较大变化（见2.1节结果），一些非嗜酸菌如微小杆菌等逐渐被替代。发酵后卤水中的主要物种有一定演替变化，但总体上比较相近，推测发酵后卤水**有的主要物种是发酵阶段的主要特征风味形成的功能菌种。
菌群结构与特征风味成分之间的相关性分析
为了进一步探究优势菌群与特征风味之间的关系，以种水平下微生物相对丰度不小于4%的优势菌群与19种特征风味成分含量进行pearson相关性分析，见图7，图中越接近红色，正相关性越强，越接近蓝色，负相关性越强。从图7可以看出，与19种特征风味物质有相关性（p＜0.05）的优势菌群有11种，其中，与c. bacterium sysu ga17129有相关性的特征风味物质数目最多，有8种，包括苯酚、丁酸、丙位十二内酯、吲哚、对甲基苯酚、3-甲基丁酸、2-庚醇、正己醇。与a. ane**inilyticus有相关性的特征风味物质数目较多，有6种，包括3-甲基丁酸、苯酚、3-甲基吲哚、丁酸、丙位十二内酯、1-辛烯-3-醇。与s. acetigenes有相关性的特征风味物质数目也较多，有5种，包括2-庚醇、正己醇、3-苯丙酸**、丁酸、异戊醇。这3种优势菌与12种特征风味物质相关（p＜0.05），涵盖了大部分的特征风味物质，尤其是c. bacterium sysu ga17129、a. ane**inilyticus与主要特征风味物质苯酚、对甲基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚有显著相关性（p＜0.05）。
结论
本实验对长沙臭豆腐卤水发酵过程特征风味物质和优势菌群及其相关性进行研究，明确与卤水特征风味关系密切的主要风味关联优势菌，但这些优势菌群的功能基因、参与的代谢通路及对特征风味物质形成所起的作用、卤水发酵商业菌种的开发等还需进一步研究。
一
通信作者简介
蒋立文，1968.11出生，湖南安化人，教授，博士，湖南农业大学博士生导师，现为食品科学与生物技术湖南省重点实验室主任，兼任国家自然科学基金评审委员会专家，天津市、浙江省、北京市自然科学基金项目评审专家，中国微生物学会会员，中国豆制品产业（刊物）专家，中国酿造杂志社编委，湖南省食品科技学会理事，湖南省调味品协会理事，湖南省质量技术监督局食品安全专家，湖南省食品质量安全技术协会监事。围绕湖南特色的发酵豆制品、发酵蔬菜等领域存在发酵机理不明、微生物资源研究有限、生产条件粗放、产品质量不稳定、无法实现标准化规模化商品化生产等问题开展研究，在毛霉菌发酵豆豉品质形成机理、南方特色臭豆腐风味形成指纹图谱、发酵蔬菜品质控制、食品安全控制方面取得较好研究成果，主持国家自然科学基金面上项目支持2项，主要参与省部级项目3项，主持或参与项目发酵大豆制品、蔬菜发酵制品及技术分别获得湖南省科技进步奖三等奖1项（排名第一）、湖南省技术发明三等奖1项（排名第一），湖南省科技进步二等奖1项（排名第三）。主持制定或参与制定湖南省地方标准2项。获得授权的国家发明专利10项。公开发表科研**50余篇，主编/副主编参与教材编写4部。
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本文《长沙臭豆腐卤水发酵过程特征风味物质及其关联菌群分析》来源于《食品科学》2023年43卷22期239-248页，作者：唐辉，陈霖，康林芝，李跑，钟瑞敏，刘国凌，蒋立文。doi:10.7506/spkx1002-联系本站老师。-019。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
food science of animal products（**sn: 2958-4124, e-**sn : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
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